In numerosi tumori – sia rari sia comuni – è presente una fusione genica del recettore della tirosin chinasi neurotrofica (Neurotrophic Tyrosine Receptor Kinase, NTRK). L’approvazione da parte dell’FDA e il prossimo arrivo nella pratica clinica quotidiana di farmaci inibitori di TRK rende essenziale l’identificazione di questa alterazione genetica in una fase precoce del percorso terapeutico del paziente oncologico. L’ESMO Translational Research and Precision Medicine Working Group ha pubblicato delle raccomandazioni in tal senso, ma un recente lavoro di JP Solomon, patologo del Memorial Sloan Kettering Cancer Center di New York, e del suo gruppo – pubblicato su “Annals of Oncology” – ha posto ancora maggiore enfasi sulla necessità di implementare un algoritmo diagnostico che preveda anche un “triage genomico” oltre a quello basato sull’istologia per identificare con sempre maggiore precisione i tumori trattabili con inibitori di TRK.
Attualmente le tecniche diagnostiche per l’identificazione della fusione di NTRK a disposizione dei clinici sono diverse, ognuna con le sue caratteristiche e i suoi pro e contro.
IMMUNOISTOCHIMICA
Utilizzare l’immunoistochimica per esaminare l’espressione della proteina TRK ha numerosi vantaggi: è una procedura comunemente utilizzata in molti laboratori e quindi facilmente implementabile e validabile, con costi contenuti. La specificità però è molto variabile a seconda del tipo di tumore. Mentre la specificità è del 100% nei tumori di colon, polmone, tiroide, pancreas e tratto biliare, è molto inferiore nei tumori della mammella e delle ghiandole salivari e specialmente nei sarcomi.
FISH
L’ibridazione fluorescente in situ (Fluorescent In Situ Hybridization, FISH) è in grado di individuare variazioni strutturali importanti a livello del DNA ed è sovente utilizzata anche per individuare la fusione genica NTRK, ma non sono infrequenti i falsi negativi, soprattutto nel caso di fusioni NTRK1.
RT-PCR
La trascrittasi inversa della reazione a catena della polimerasi (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) può essere utilizzata per individuare la presenza di RNA trascritto e – sia qualitativamente che quantitativamente – per individuare fusioni geniche in cui entrambi i membri della fusione sono noti. Nel caso delle fusioni di NTRK la situazione è spesso molto complessa e quindi l’utilità della RT-PCR è limitata. È stata utilizzata in passato soprattutto per individuare le fusioni note ETV6-NTRK3.
NEXT GENERATION SEQUENCING DEL DNA
Nel Next Generation Sequencing (NGS) DNA-based il DNA tumorale viene estratto da tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina e poi sequenziato. Un possibile limite della procedura è che quando vengono individuate nuove varianti strutturali può risultare difficoltoso determinare se si traducono effettivamente in fusioni funzionalmente espresse.
NEXT GENERATION SEQUENCING DELL’RNA
Con il Next Generation Sequencing (NGS) RNA-based si hanno numerosi vantaggi rispetto al NGS DNA-based. L’NGS basata su RNA effettua il sequenziamento di mRNA maturi mediante trascrizione e splicing (con introni già rimossi). Si aggirano così le difficoltà associate al sequenziamento delle fusioni del gene NTRK e si è in grado di distinguere le fusioni geniche trascritte in-frame da quelle out-of-frame. Inoltre l’individuazione di fusioni a livello dell’RNA garantisce la sicurezza che siano funzionalmente trascritte, e le trascrizioni di fusioni sono individuabili con facilità anche in campioni a bassa purezza perché over-espresse nel tessuto. Va infine sottolineato che sono disponibili in commercio piattaforme in grado di gestire in simultanea sia DNA che RNA: le rispettive librerie sono preparate separatamente, ma possono essere combinate per un’analisi completa.
Nel selezionare le procedure diagnostiche più adatte a individuare le fusioni di NTRK è importante valutare non solo l’efficacia ma anche la fattibilità e il costo di tali procedure. I triage quindi non dovrebbero essere basati solo sul tipo di tumore e sulla probabilità pre-test di presenza di fusioni di NTRK, ma anche sulla disponibilità di metodologie clinicamente validate con i loro pro e contro nella capacità predittiva. Va da sé che un algoritmo diagnostico adatto a tutte le situazioni cliniche e a tutti i laboratori è difficile da implementare.
Quello proposto da Solomon et al prevede che prima venga condotto un triage istologico che permetta di individuare preliminarmente e separare i sottotipi di tumore raro in cui si riscontrano comunemente fusioni di NTRK, da quelli in cui è presente una bassa probabilità pre-test di fusioni di NTRK. In seconda battuta diversi test di conferma andranno effettuati a seconda del tipo di tumore. Condurre un triage genomico sulla grande massa dei tumori può essere utile per selezionare – grazie all’analisi dello status dei driver oncogenici – i casi da sottoporre a screening sulla fusione di NTRK.
Bibliografia. Solomon JP, Benayed R, Hechtman JF, Ladanyi M. Identifying patients with NTRK fusion cancer. Annals of Oncology 2019;30(Supplement 8):viii16–viii22 doi:10.1093/annonc/mdz384
